Это многостраничный вид для печати этого раздела. Нажмите здесь для печати.
В ходе планирования исследований антибиотикорезистентности следует учесть как можно больше составляющих. Если участники исследования без должной тщательности подойдут к их выбору и оценке, то в результате могут быть получены данные, имеющие низкую научную и практическую значимость. Рекомендуемые этапы мониторинга представлены на рисунке 1.
При условии отсутствия задачи по исследованию конкретной бактерии и с учётом отсутствия в Российской Федерации официально утверждённого списка выделяемых от животных бактерий, приоритетных для исследований антибиотикорезистентности, предлагаем основывать выбор бактерий на рекомендациях упомянутых выше международных организаций: МЭБ, ВОЗ и ФАО.
МЭБ в главе 6.8 Кодекса здоровья наземных животных [10] предлагает включать в программы исследования антибиотикорезистентности:
ВОЗ в Объединённом руководстве по исследованиям антибиотикорезистентности бактерий — возбудителей пищевых токсикоинфекций [11] , посвящённому в том числе и исследованию бактерий от животных, указывает, что наиболее часто в программы мониторинга антибиотикорезистентности включают Salmonella spp., Campylobacter spp., E. coli и Enterococcus spp. Дополнительно могут быть добавлены Staphylococcus spp., Clostridiales и Vibrio spp.
Руководство ФАО по исследованиям и мониторингу антибиотикорезистентности бактерий, выделяемых от здоровых продуктивных животных [12] (далее в тексте «Руководство ФАО») указывает порядок приоритета бактерий, выделяемых от животных и из продуктов питания, для включения их в программы мониторинга: (1) E. coli, (2) Salmonella spp., (3) Enterococcus faecium и Enterococcus faecalis, (4) Campylobacter spp.
В 2017 г. ВОЗ опубликовала список бактерий, для которых, в связи с распространением антибиотикорезистентности срочно требуется разработка новых антибиотиков [13] . Бактерии поделены на три категории — среднего, высокого и критического приоритета. Из зоонозных бактерий в группу высокого приоритета включили устойчивые к ванкомицину Enterococcus faecium, метициллин-резистентные и устойчивые к ванкомицину Staphylococcus aureus, устойчивые к фторхинолонам Campylobacter spp., устойчивые к фторхинолонам Salmonella spp.; в группу критического приоритета — устойчивые к карбапенемам и продуцирующие бета-лактамазы расширенного спектра (БЛРС) бактерии порядка Enterobacterales, включая E. coli и Salmonella spp.
Таким образом, все три международные организации — МЭБ, ВОЗ и ФАО едины во мнении, что приоритетными являются: E. coli, Salmonella spp., Campylobacter spp. и Enterococcus spp. Кроме того, может быть исследована устойчивость и других зоонозных бактерий, в частности, Listeria monocytogenes, Vibrio spp. (выделяют из водных животных), стафилококков, в особенности MRSA. Для идентификации MRSA требуются дополнительные предварительные исследования чувствительности.
В случае, если есть возможность включить только одну бактерию, оптимальным будет являться выбор E. coli. Приоритетные бактерии представлены в таблице 2.
Таблица 2. Информация о приоритетных бактериях, выделяемых от животных, для включения в программы мониторинга
| ПРИОРИТЕТНЫЕ БАКТЕРИИ | |
| Индикаторные (комменсальные) бактерии | |
| E. coli (наивысший приоритет) | Грамотрицательная бактерия |
| Enterococcus spp. | Грамположительные бактерии, рекомендуется идентификация до вида, приоритетные — Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium |
| Зоонозные бактерии | |
| Salmonella spp. | Рекомендуется идентификация до серовара, поскольку от него зависит профиль устойчивости |
| Сampylobacter spp. | Рекомендуется идентификация до вида, приоритетные — Campylobacter jejuni и Campylobacter coli |
| ПРИМЕРЫ ДОПОЛНИТЕЛЬНЫХ ЗООНОЗНЫХ БАКТЕРИЙ | |
| Staphylococcus spp. | Рекомендуется идентификация до вида, приоритетный — Staphylococcus aureus |
| Listeria spp. | Рекомендуется идентификация до вида и исследования одного, наиболее актуального патогена — Listeria monocytogenes |
| Vibrio spp. | Рекомендуется идентификация до вида, приоритетные — Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus и Vibrio vulnificus |
Антимикробные препараты активно применяются в ветеринарии с целью лечения инфекционных заболеваний, их профилактики, а также стимуляции роста. Последние два вида использования наиболее опасны с точки зрения развития антибиотикорезистентности зоонозных бактерий. Приблизительно 70–80% от общего объёма антибактериальных средств, применяемых в медицине и ветеринарии, приходятся на ветеринарию. Из всех применяемых для животных антибактериальных препаратов, приблизительно 70% используются для терапии инфекционных заболеваний у человека.
Учитывая, что в ветеринарии и медицине активно применяется значительное количество антимикробных препаратов (несколько сотен), их выбор для включения в программу мониторинга антибиотикорезистентности является непростой задачей.
Для включения антимикробных препаратов в программу мониторинга могут быть предложены следующие критерии:
ВОЗ составила список критически важных для медицины антимикробных препаратов. Последняя на сегодняшний день, 6-я версия документа была опубликована в 2019 г. [14] . В списке осуществлено ранжирование значимых для медицины антибиотиков по степени риска возникновения к ним устойчивости, связанным с их использованием для животных. Антимикробные препараты разделены на три группы: важные, особой важности и критически важные.
Европейское медицинское агентство (EMA, European Medicines Agency) провело категоризацию антибиотиков при их применении в животноводстве по критериям риска для здоровья человека и животных [15] .
EMA разделило антибиотики на 4 категории (таблица 3). В Российской Федерации НИИ Антимикробной химиотерапии (г. Смоленск) составило актуальный Перечень антибиотиков, рекомендованный для проведения эпидемиологического наблюдения за антибиотикорезистентностью приоритетных возбудителей заболеваний человека, указанный в разделе 3.5.3.2. Практического руководства по мониторингу антибиотикорезистентности с использованием платформы AMRcloud [16] . АМП указаны в соответствии с группами микроорганизмов, для которых следует определять чувствительность данного АМП (https://monitoring.amrcloud.net/docs/03/05 ).
Из зоонозных бактерий в список включены АМП, активные в отношении антибиотики против порядка Enterobacterales (куда входят E. coli и Salmonella spp.), Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis и Enteroccus faecium.
Таблица 3. Категории антибактериальных препаратов, применяемых в животноводстве по критериям риска для здоровья человека и животных
| Название категории | Описание категории |
|---|---|
| Категория А (Необходимо избегать применения) | Антибиотики, не зарегистрированные к применению в Евросоюзе для животных. |
| Категория В (Ограничить применения) | Критически важные для медицины антибиотики. Для продуктивных животных их следует использовать только для лечения и только в тех случаях, когда другие антибиотики неэффективны. В данную категорию отнесли фторхинолоны, цефалоспорины III–IV поколения и полимиксины (колистин). |
| Категория С (Использовать с осторожностью) | Антибиотики, которые следует применять только, если не будет эффективным использование антибиотиков из группы D. |
| Категория D | Антибиотики, представляющие наименьший риск. |
МЭБ составила список наиболее важных антибиотиков для ветеринарии, последняя на сегодняшний день версия которого была выпущена в 2021 г. [17] Также, как и в списке ВОЗ, антибиотики поделены на важные, особо важные и критически важные.
Список зарегистрированных в России антибиотиков для ветеринарного применения доступен в формате Excel в Государственном реестре лекарственных средств для ветеринарного применения [18] .
В таблице 4 приведены зарегистрированные в России антибиотики для продуктивных животных, включённые ВОЗ в группы критически важных и особо важных для сферы общественного здравоохранения [14] .
Россельхознадзор собирает с регионов сведения о применении антибактериальных средств в каждом хозяйстве. Информация находится в закрытом доступе, но для её получения может быть направлен запрос в Центральный аппарат Россельхознадзора.
В целом при составлении списка исследуемых антибиотиков можно рекомендовать гибкий подход, предполагающий включение с одной стороны важных для медицины антибиотиков, которые не зарегистрированы в нашей стране для продуктивных животных и не применяются в ветеринарии, (например, меропенема для кишечной палочки и ванкомицина для энтерококков), а с другой стороны напротив, антибиотиков, которые значительно более важны для ветеринарии, чем для медицины (например, кормовые антибиотики виргиниамицин и бацитрицин для энтерококков).
Таблица 4. Антибактериальные препараты, применяемые для продуктивных животных и представленные в списках ВОЗ как важные и особо важные для сферы общественного здравоохранения
| Класс антимикробных средств | Представители класса |
| Критически важные для медицины антибиотики | |
| Фторхинолоны* | Ципрофлоксацин, норфлоксацин, флумеквин, марбофлоксацин |
| Полимиксины | Колистин* |
| Цефалоспорины III и выше поколений* | Цефкином (IV поколение), цефподоксим (III поколение), цефотаксим (III поколение) |
| Аминогликозиды | Гентамицин, неомицин, канамицин |
| Анзамицины | Рифампицин |
| Макролиды | Азитромицин, эритромицин, спирамицин |
| Пенициллины | Ампициллин, амоксициллин, феноксиметилпенициллин, бензилпенициллин, клоксациллин |
| Особо важные для медицины антибиотики | |
| Амфениколы | Хлорамфеникол |
| Цефалексин, цефалоним, цефапирин | Ампициллин, амоксициллин, феноксиметилпенициллин, бензилпенициллин, клоксациллин |
| Тетрациклины | Тетрациклин, окситетрациклин, хлортетрациклин, доксициклин |
| Линкозамиды | Линкомицин, клиндамицин |
| Сульфаниламиды/диаминопиримидины | Сульфаметоксазол-триметоприм |
* — фторхинолоны, колистин и цефалопорины III–IV поколений рассматриваются международными организациями как наиболее важные для медицины антибиотики, на устойчивость к которым влияет их применение в животноводстве, соответственно, их можно рассматривать и как приоритетные для включения в программы исследования устойчивости.
Данная составляющая планирования является критически важной, поскольку, если антибиотик важен для медицины и активно применяется в ветеринарии в России, это совсем не означает, что для него имеются международно признанные критерии интерпретации по определению чувствительности.
Критерий интерпретации — это табличное значение минимальной подавляющей концентрации — МПК (для метода серийных разведений) или диаметра зоны задержки роста (для диско-диффузионного метода), которое позволяет определить: будет ли исследуемый изолят отнесён к категории чувствительных или устойчивых к воздействию антибиотика.
Включение в программу исследований комбинаций «бактерия-антибиотик», для которой критерии интерпретации отсутствуют, имеет смысл только в том случае, если стоит цель накопить данные о распределении активности исследуемого АМП в отношении популяции конкретного вида микроорганизма (формирование популяционных распределений МПК и диаметров зон подавления роста).
Критерии интерпретации могут быть указаны для клинической и микробиологической устойчивости. Отличие микробиологической и клинической устойчивости рассмотрено в разделе 3.5.2. Практического руководства по мониторингу антибиотикорезистентности с использованием платформы AMRcloud [16] . Критерии интерпретации (точки отсечения) устанавливают в разных странах, при этом за основу берут критерии, разрабатываемые двумя организациями — Европейским комитетом по определению чувствительности к антимикробным средствам (European Committee of Antimicrobial Susceptibility Testing, EUCAST) и Институтом клинических и лабораторных стандартов США (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI).
Обе организации устанавливают критерии чувствительности для микроорганизмов-возбудителей инфекционных заболеваний у человека (клинической устойчивости), при этом сами значения точек отсечения могут отличаться, совпадая, в целом, на 80–90%. EUCAST также определяет критерии микробиологической устойчивости, а CLSI — главным образом критерии клинической устойчивости для животных, как продуктивных, так и домашних. Ветеринарные критерии необходимы в первую очередь при исследовании патогенов животных.
Критерии устойчивости EUCAST доступны на официальном сайте EUCAST — микробиологической [19] и клинической устойчивости [20] .
Критерии клинической устойчивости CLSI, как медицинские, так и ветеринарные, доступны в соответствующих стандартах на официальной странице учреждения [21] .
Для основных клинически значимых возбудителей заболеваний у человека точки отсечения указаны в стандарте CLSI M100 ED32:2022 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 32nd Edition (Стандарты проведения исследований на чувствительность к антимикробным препаратам, 32-е издание) [22] .
В Российской Федерации Межрегиональная ассоциация по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии (МАКМАХ) публикует рекомендации по определению чувствительности бактерий к антибиотикам, которые содержат, в том числе точки отсечения. За основу предлагаемых МАКМАХ критериев взяты клинические точки отсечения EUCAST [23] .
Прежде, чем включить какой-либо антибиотик в программу исследований, необходимо удостовериться, что для него имеются критерии клинической, либо микробиологической устойчивости, либо обоих видов устойчивости — в зависимости от целей исследования.
Критерии интерпретации микробиологической и клинической устойчивости по версиям EUCAST и СLSI могут значительно различаться не только по значениям, но и по наличию. Для одних антибиотиков может присутствовать только микробиологическая точка отсечения, для других — только клиническая EUCAST или CLSI и т.д.
В случае, если исследования устойчивости бактерий к определённому антибиотику представляет особую важность, но точки отсечения отсутствуют, существует методология самостоятельного определения микробиологических точек отсечения. Критерии интерпретации и EUCAST, и СLSI подлежат ежегодному пересмотру, и нельзя исключить их изменения или даже исчезновения в более свежей версии стандартов. Поэтому при планировании исследования необходимо брать критерии из последней на данный момент версии стандартов.
В целом, перечень АМП, использующихся в ветеринарии и для которых доступны критерии интерпретации, ограничен.
Для упрощения процедуры планирования можно рекомендовать: составить таблицу, в которой для каждого их выбранных антибиотиков будут указано, какие критерии для него существуют.
При планировании исследований антибиотикорезистентности необходимо убедиться, что для выбранных антибиотиков на отечественном рынке доступны стандартные образцы достаточной химической чистоты для метода серийных разведений и диски с нанесёнными на них антибиотиками для диско-диффузионного метода.
Данный критерий важен для того, чтобы иметь возможность сопоставить свои данные с данными мониторинга, проведённого другими отечественными и зарубежными организациями. Сравнение даёт более широкое поле для анализа собственных данных и выводов из них — как в научном аспекте, так и в практическом аспекте разработки управленческих мер.
Источники данных указаны в разделе 4 настоящего руководства «Системы мониторинга и источники данных об антибиотикорезистентности зоонозных и индикаторных бактерий, выделяемых от животных».
Из каждого класса целесообразно выбрать не более 1–2 антибиотиков. Если два антибиотика относятся к одному классу, то это должны быть антибиотики, устойчивость к которым формируется за счет различных механизмов, например, гентамицин и стрептомицин для E. coli. Напротив, не стоит брать антибиотики с перекрёстной устойчивостью, приближающейся к 100%, например ципрофлоксацин и энрофлоксацин для кишечной палочки. Если антибиотик применяют в комбинации с другим или с ингибитором разрушающих его ферментов, то их также целесообразно включать в программу.
По результатам анализа приведённых выше документов и списков, а также собственного опыта, можно предложить минимальный набор антибиотиков для тестирования приоритетных групп бактерий (таблица 5).
Таблица 5. Набор антибактериальных препаратов для тестирования приоритетных групп бактерий
| Группа антибактериальных средств | Примеры представителей группы, рекомендуемые для включения в программу |
| E. coli и Salmonella spp. | |
| Фторхинолоны | Ципрофлоксацин |
| Цефалоспорины III и выше поколений | Цефотаксим |
| Полимиксины | Колистин |
| Амфениколы | Хлорамфеникол |
| Пенициллины | Ампициллин |
| Тетрациклины | Тетрациклин |
| Сульфаниламиды | Сульфаметоксазол |
| Сульфаниламиды/Триаминопиримидины | Триметоприм/сульфаметоксазол |
| Аминогликозиды | Гентамицин |
| Карбапенемы | Меропенем |
| Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium | |
| Пенициллины | Ампициллин |
| Амфениколы | Хлорамфеникол |
| Фторхинолоны | Ципрофлоксацин |
| Макролиды | Эритромицин |
| Аминогликозиды | Гентамицин |
| Тетрациклины | Тетрациклин |
| Гликопептиды | Ванкомицин |
| Кормовые антибиотики | Бацитрацин, вирджиниамицин |
| Campylobacter jejuni и Campylobacter coli | |
| Фторхинолоны | Ципрофлоксацин |
| Макролиды | Эритромицин |
| Аминогликозиды | Гентамицин, стрептомицин |
| Тетрациклины | Тетрациклин |
Для выбора животных, от которых будут отбирать пробы биоматериала или соответствующего пищевого сырья, необходимо определить, какие из них несут наибольший риск передачи устойчивых бактерий человеку.
Это связано в первую очередь с объёмами потребления мяса и субпродуктов того или иного вида животных в исследуемой стране/регионе, отличиями в профилях устойчивости бактерий от разных видов животных, являющихся прямым следствием характера применения для них антибиотиков.
Если планируется исследование E.coli от животных с отбором проб по всей территории России, то целесообразно будет включить в программу образцы от птицы.
Птица — наиболее активно употребляемое в пищу населением России мясо. Устойчивость E.coli, выделенной от птицы, как правило, выше, чем от других животных — свиней, коров и т.д. Это связано с активным применением антибиотиков в птицеводстве с профилактическими целями. Без антибиотиков цыплят бройлеров в крупных птицеводческих хозяйствах не выращивают.
Планирование должно учитывать и региональную специфику. Так, если программа предназначена для какого-либо региона крайнего севера, то целесообразно включить в неё образцы от северных оленей.
Отбор проб от разных видов животных позволяет получить более полные и пригодные данные для разработки управленческих мер.
Приоритетными для России могут быть названы три вида животных: куры, коровы и свиньи.
При планировании и отборе проб также необходимо учитывать категорию животных, например, мясной или молочный КРС, взрослые свиньи или поросята, поскольку для разных категорий животных устойчивость может отличаться.
Отбираемые образцы можно разделить на три типа: биоматериал животных, объекты внешней среды и сырьё животного происхождения.
Биоматериал:
Объекты внешней среды:
Если для сравнения проводятся исследования бактерий из входящего материала, то может быть взята чистая подстилка, корм.
Сырьё животного происхождения:
Образцы биоматериала от животных могут быть отобраны непосредственно в хозяйстве или в убойном пункте. Образцы сырья животного происхождения — в убойном пункте или в торговой точке.
Согласно Руководству ФАО [12] , оптимальным является отбор проб в конце производственного цикла, т.е. на убойном пункте, за исключением кур-несушек и молочного КРС. Отбор мяса/субпродуктов из торговых точек рассматривается скорее как дополнительная опция.
Образцы необходимо отбирать от здоровых, без признаков болезней, животных, поскольку заболевшие животные, как правило, подвергаются воздействию антибиотиков, и выделенные из них бактерии имеют более высокий риск развития устойчивости. Отбор проб следует производить от случайно выбранных животных или групп животных с целью получения репрезентативных данных.
Пробы могут быть отобраны как от отдельных животных, так и в виде сборной пробы.
Предпочтительным является отбор проб от отдельных животных. У млекопитающих и птицы могут быть взяты мазки из прямой кишки/клоаки — как от живых животных, так и после убоя.
Руководство ФАО [12] рекомендует отбор на убойном пункте целиком слепой кишки (цекума). Цекум позволяет получить более точные данные по устойчивости, отражающие характер применения антибиотиков в хозяйстве, чем клоакальные/ректальные мазки, поскольку для последних двух типов проб выше вероятность контаминации посторонними бактериями — от людей и т.д.
В случае отбора сборной пробы фекалий в птичнике может быть использована технология Boot Swab («Обувной тампон»), которая заключается в том, что смоченный пептонной водой одноразовый тампон наклеивают на подошву обуви, проходят по птичнику, снимают тампон с обуви вместе с налипшими фекалиями и помещают в стерильный контейнер. По сути, данный образец является подстилкой, т.е. объектом внешней среды.
Сборные пробы фекалий из коровника и свинарника можно отбирать с пола, в разных местах, стараясь, по возможности, набрать в пробирку материал из глубины кучи помёта, который не контактировал с поверхностями и воздухом.
Для объектов внешней среды ещё выше, чем для ректальных/клоакальных мазков и фекалий вероятность того, что выделенные из них бактерии будут иметь происхождение от людей и из окружающей среды, а не от животных. То же относится и к образцам пищевого сырья животного происхождения.
При этом, в зависимости от целей исследований, может быть рациональным отбор именно объектов внешней среды и пищевого сырья.
Если есть необходимость исследовать изоляты именно от животных, чтобы оценить влияние применения антибиотиков в хозяйстве на уровни устойчивости, предпочтительным является цекум или клоакальный/ректальный мазок. Когда стоит задача исследования штаммов, циркулирующих в хозяйстве, как от людей, так и от животных, то лучшее представление будет получено при исследовании объектов внешней среды. Если задача — определить профиль устойчивости бактерий на конечном этапе производства и реализации, т.е. непосредственно тех бактерий, которые могут заразить людей при употреблении в пищу мяса и др. продукции, то целесообразен отбор пищевого сырья.
Таблица 6. Рекомендации по виду животных и типам образца
| Параметр | Приоритеты |
|---|---|
| Состояние животных | Строго здоровые животные, без признаков бактериальных заболеваний |
| Виды животных | Птица (курица), корова, свинья |
| Категория животных | Для кур — цыплята-бройлеры, для свиней и коров — взрослые животные на заключительном этапе откорма |
| Места отбора проб | Убойный пункт |
| Тип образца | Цекум, ректальный/клоакальный мазок, фекалии |
Таблица 7. Рекомендации по месту отбора проб и типам образца из Руководства ФАО
| Животные | Место отбора проб | Виды бактерий и типы образцов | |||||
|
Salmonella spp. |
E. coli |
C. coli |
C. jejuni |
E. faecium |
E. faecalis |
||
| Куры-бройлеры | Хозяйство | Обувной тампон | |||||
| Куры-бройлеры | Убойный пункт | Цекум | Цекум | Цекум | Цекум | Цекум | Цекум |
| Куры-несушки | Хозяйство | Обувной тампон | |||||
| Свиньи | Убойный пункт | Цекум/ректальный мазок | Цекум | Цекум | Цекум | Цекум | |
| КРС | Убойный пункт | Цекум/ректальный мазок | Цекум | Цекум | Цекум | ||
| Мясо бройлеров | Убойный пункт, роз- ничная торговая точка | Кожа | Кожа | Кожа | |||
| Свинина | Убойный пункт, роз- ничная торговая точка | Мясо | Мясо | Мясо | Мясо | Мясо | |
| Говядина | Убойный пункт, роз- ничная торговая точка | Мясо | Мясо | Мясо | Мясо | ||
При оптимальном варианте программа исследований антибиотикорезистентности охватывает до 80% поголовья животных в исследуемой стране/регионе. Отбор образцов должен быть репрезентативным и случайным. При этом может учитывать ожидаемые уровни устойчивости (т.е. доли устойчивых изолятов) и требуемую статистическую значимость.
Приложение 1 Руководства ФАО [12] содержит формулу для расчёта необходимого количества изолятов:
Если величина ожидаемой распространённости неизвестна, то её, как правило, берут равной 50%, поскольку при этом потребуется анализ максимального количества изолятов. В этом случае при 95% доверительной интервале и прогрешности в 5% требуемое количество образцов будет равным:
Для расчёта требуемого количества изолятов могут быть использованы специальные программы, доступные в интернете:
Данные программы позволяют также выбирать значение параметра поголовья животных.
Указанная методика расчёта количества изолятов необходима только для широкомасштабных исследований, на уровне всей страны или, как минимум, региона. В отчётах и научных публикациях не встречалось упоминаний о её применении.
В целом, при определении количества изолятов в исследованиях устойчивости любого масштаба следует руководствоваться принципом, изложенных в разделе 6.8.4. Кодекса здоровья наземных животных МЭБ «Количество образцов должно быть достаточно большим для обнаружения либо выявления уровней или трендов имеющейся или прогнозируемой фенотипической устойчивости».
При определении количества образцов необходимо учесть вероятность выделения из образца изолята требуемой бактерии. Например, для E. coli он гипотетически может быть близок к 100%, для E. faecalis и E. faecium — 80%, Salmonella spp. — 40%, Campylobacter spp. — 10%. На кампилобактерии в этом плане следует обратить особое внимание, т.к. вероятность их выделения из образца относительно невысока. Таким образом, планируемое количество проб следует скорректировать на вероятность получения из них изолятов.
При отборе образцов все доступные места следует разделить на эпидемиологические единицы. Считается, что профиль устойчивости бактерий одного вида (энтерококки, кампилобактерии и E. coli) или одного серовара (Salmonella spp.), выделенных из образцов, отобранных в одной и той же эпидемиологической единице, будет в значительной степени схожим, поскольку животные находятся в одинаковых условиях, в том числе в аспекте применения антибиотиков. Для свиней на откорме и КРС эпидемиологической единицей является всё стадо в хозяйстве.
Для цыплят-бройлеров — изолированное поголовье, т.е. птица, выращиваемая в одних и тех же условиях, в одном и том же помещении. В крупных птицеводческих хозяйствах эпидемиологической единицей можно считать цех.
При проведении масштабных исследований, включающих в себя большое количество хозяйств (начиная от нескольких десятков), количество изолятов из одной эпидемиологической единицы необходимо минимизировать, в идеале оно должно быть равным 1. Значительное количество изолятов из одного хозяйства может привести к противоречивым результатам и запутать исследователей. Таким образом, предпочтительнее выделить меньше изолятов из большего количества хозяйств, чем наоборот. Если планируются исследования на постоянной основе, т.е. мониторинг, то для изучения временной динамики антибиотикорезистентности образцы из одной и той же эпидемиологической единицы следует отбирать раз в год, при этом желательно, чтобы месяц отбора проб каждый год совпадал. Рекомендации по планированию отбора образцов резюмированы в таблице 8.
Таблица 8. Рекомендации по месту отбора проб и типам образца из Руководства ФАО
| Параметр | Рекомендация |
|---|---|
| Планируемое количество образцов | Количество проб должно быть достаточным для выявления уровней и трендов устойчивости. При масштабных исследованиях возможно использование формул для расчёта образцов, учитывающих ожидаемый уровень устойчивости, необходимую погрешность и доверительный интервал. |
| Вероятность выделения изолята из пробы | Количество образцов необходимо скорректировать с учётом данного показателя. Низкая вероятность выделения изолята из образца требует отбора большего количества образцов, что особенно актуально для кампилобактерий. |
| Количество изолятов из одного хозяйства | Общее правило — больше хозяйств, меньше изолятов из одного хозяйства. В идеале, в птицеводческих хозяйствах следует отбирать количество образцов, необходимое для выделения одного изолята на каждый цех птицеводческого хозяйства. Для свиноводческих предприятий и предприятий по выращиванию КРС — количество образцов, необходимое для получения одного изолята на хозяйство. |
| Отбор образцов при мониторинге, для изучения временных трендов | Необходимо отбирать образцы в одной и той же эпидемиологической единице один раз в год, желательно в один и тот же месяц. |
Отбор образцов должен производиться в асептических условиях, со всеми необходимыми мерами биологической безопасности, сотрудниками, имеющими соответствующую квалификацию и опыт.
Слепую кишку от птицы на убойном пункте лучше всего отбирать в течение 10 минут после убоя, следя за тем, чтобы она была интактной и наполненной.
Согласно принципу репрезентативности и случайности, образцы следует отбирать от разных партий птицы. Одной партией можно считать птицу, которая находилась вместе в одном хозяйстве и подвергалась одинаковому воздействию антибиотиков. Допускается создание сборной пробы нескольких цекумов от разных птиц из одной партии. Цекумы помещают в стерильный специальный пакет или контейнер для отправки в лабораторию. На убойном пункте могут быть отобраны также целые тушки птицы или с них могут быть сделаны смывы.
Данные рекомендации подходят и для отбора цекумов от млекопитающих. Отбор образцов производится от разных партий животных из разных эпидемиологических единиц (поголовье животных в одном хозяйстве).
При отсутствии возможности отобрать цекум, асептическим образом могут быть взяты фекалии из кишечника после убоя животного.
В хозяйствах могут быть произведены клоакальные/ректальные мазки, отбор фекалий и объектов внешней среды.
Помещённый в стерильный контейнер/пакет образец следует промаркировать, указав сведения о нём как можно более полно и достоверно.
Рекомендации сведений об образце, которые необходимо собрать:
Образцы в стерильных пакетах или контейнерах необходимо транспортировать при температуре не выше 10°С, но не допуская замораживания. Для этого могут быть использованы транспортные термокороба с помещёнными внутрь солевыми хладоэлементами (аккумуляторами холода).
Образцы необходимо транспортировать способом, исключающим обмен бактерий между ними и окружающей средой и попаданием материала одного образца в другой.
Необходимо соблюдать принцип тройной упаковки проб:
Образцы следует доставить в лабораторию немедленно, лучше в срок до 24 часов и сразу отправить в работу. Если это невозможно, допускается хранение при 3–7°С в течение 72-х часов после отбора.
Campylobacter spp. особенно чувствительны к внешнему воздействию, включающему дегидратацию, прямые солнечные лучи, кислород, повышенные температуры. Поэтому для них правило немедленной доставки в лабораторию особенно актуально, следует избегать воздействия указанных факторов, температуры выше 20°С и перепадов температуры. Если время между отбором образца на кампилобактерии и началом работы с ним превышает 48 ч., хранить его рекомендуется при температуре 4 ± 2°С.