6.1 Выбор разведений при постановке метода серийных разведений и контроль качества

При подготовке к постановке метода серийный разведений в бульоне встаёт вопрос: сколько лунок и с какими концентрациями антибиотиков запланировать для опытных изолятов каждой бактерии? Разведения антибиотика должны быть выбраны таким образом, чтобы с высокой вероятностью обнаружить концентрацию, соответствующую МПК, иначе опыт придётся переделывать, пока нужные разведения не будут подобраны эмпирически.

Перечень концентраций, которые определяются заранее с целью определить МПК всех опытных изолятов и контрольных штаммов называют диапазоном рабочих концентраций.

При выборе диапазона рабочих концентраций необходимо учитывать контрольные диапазоны, микробиологические и клинические точки отсечения.

Контрольный диапазон — это табличное значение диапазона МПК для контрольного штамма. Контрольный штамм — это штамм дикого типа, не обладающий приобретённой устойчивостью к тем антибиотикам, для контроля исследования, которых он предназначен.

Постановку контрольного штамма необходимо ставить в каждой серии с опытными образцами. Контрольные штаммы, предусмотренные международными стандартами методов определения чувствительности к антибиотикам (EUCAST и СLSI) — имеют порядковый номер коллекции ATCC (Американской коллекции типовых культур). Заказать их можно через различных зарубежных и отечественных поставщиков, также ряд отечественных медицинских и ветеринарных научных учреждений имеют эти контрольные штаммы в своих коллекциях с возможностью передачи. Если полученное для контрольного штамма в ходе эксперимента значение МПК находится в пределах контрольного диапазона, то результаты для опытных изолятов, поставленных в той же серии, можно считать валидными.

Если полученные для контрольного штамма значения МПК выходят за пределы контрольного диапазона, то опыт необходимо переделать. Возможно, проблема в том, что концентрация антибиотика не соответствует требуемой (например, ошибка в разведении, некачественный стандарт с содержанием антибиотика ниже заявленного).

Если концентрация антибиотика в реальности ниже ожидаемой, то полученное для контрольного штамма МПК будет смещено вправо относительно диапазона, т.е. превысит его верхний предел.

В целом, для контроля качества приоритетных групп бактерий оптимальной может быть признаны следующие положения:

Для E. coli и сальмонелл в каждой серии ставят контроли для всех антибиотиков со штаммом E. coli ATCC 25922.
Если для E. coli ATCC 25922 какого-то антибиотика нет, то следует брать в этом случае штамм Enterococcus faecalis ATCC 29212 так, чтобы для каждого антибиотика в каждой серии обязательно был контроль. В результате, для многих антибиотиков качество результатов будет проверено сразу по двум контрольным штаммам.
Для энтерококков используют штамм Enterococcus faecalis ATCC 29212.
Стрептомицин, сульфадиазин, сульфаметоксазол, эритромицин и др. можно ставить без контролей (поскольку для Enterococcus faecalis ATCC 29212 и E. coli ATCC 25922 контрольные значения отсутствуют).
Для кампилобактерий используют штамм Campylobacter jejuni ATCC 33560, а для антибиотиков не имеющих допустимых диапазонов для данного штамма, можно поступать как со стрептомицином, сульфадиазином и сульфаметоксазолом — ставить эксперимент без контроля.

Более подробно порядок проведения контроля качества изложен в Рекомендациях МАКМАХ «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам (2021)».

Существует также дополнительный инструмент контроля полученных данных — построение графика распределения МПК и сравнение его с табличными значениями EUCAST. Данный инструмент особенно актуален для антибиотиков, для которых отсутствуют контрольные диапазоны.

На графике распределения МПК по оси абсцисс отложены все значения МПК, зафиксированные для исследованных изолятов, а по оси ординат — доля изолятов с данным МПК среди общего количества изолятов. Зелёным или синим цветом на графике, как правило, обозначают столбцы чувствительных изолятов, МПК которых ниже точки отсечения, жёлтым — чувствительных при увеличенной экспозиции, красным — устойчивых.

Графики распределения МПК, полученные EUCAST, доступны на официальном сайте организации [19] .

Для примера на рисунке 1 представлен график распределения МПК тетрациклина для E. coli.

График распределения МПК тетрациклина для E. coli с официального сайта EUCAST

Чтобы увидеть график распределения, необходимо зайти в базу данных «MIC Distributions and ECOFFs» (Распределение МПК и микробиологические точки отсечения), выбрать бактерию и нажать на антибиотик из списка, либо, наоборот, выбрать антибиотик и нажать на бактерию. В таблице указано количество изолятов и на графике, которые были происследованы для его получения.Внешний вид базы представлен на рисунке 2.

Снимок экрана с базой данных «MIC Distributions and ECOFFs»

Система AMRcloud позволяет легко строить график распределения МПК для комбинаций «бактерия-антибиотик», исследованных в рамках программы AMRcloud (см. раздел 5 «Использование платформы AMRcloud в мониторинге антибиотикорезистентности» Руководства по мониторингу с AMRcloud, 5.3. Углублённый анализ данных, 5.3.1.3 Подвкладка «МПК») [16] .

Если пики на табличном (с сайта EUCAST) и опытном графике совпадают, это является дополнительным подтверждением валидности результатов.
Если у опытного графика заметен явный сдвиг относительно табличного — на одну или несколько концентраций, это может свидетельствовать о проблемах, возникших при постановке опыта.

После установления контрольных диапазонов выбирают тестируемые концентрации антибиотиков.

Далее при определении диапазона рабочих концентраций необходимо учесть:

Точки отсечения микробиологической устойчивости (ECOFF).
Точки отсечения клинической устойчивости по системе EUCAST.
Точки отсечения клинической устойчивости по системе CLSI.

Значения из таблиц МАКМАХ, EUCAST и СLSI интерпретируют следующим образом (Х — значение МПК опытного штамма, Min — минимальное значение, Maх — максимальное):

Микробиологическая устойчивость:
- Если А ≤ Min, то изолят относится к категории S (чувствительный), если А > Min, то к категории — R (устойчивый).
Клиническая устойчивость по критериям EUCAST/МАКМАХ:
- Если А ≤ Min, то изолят относится к категории S (чувствительный), если А > Min и А ≤ Max, то к категории «I» (ранее «промежуточно устойчивый», в настоящее время — «чувствительный при увеличенной экспозиции»), если А > Max, то к категории — R (устойчивый).
Клиническая устойчивость по критериям CLSI:
- Если А ≤ Min, то изолят относится к категории S (чувствительный), если А > Min и А < Max, то к категории «I» (промежуточно устойчивый), если А ≥ Max, то к категории — R (устойчивый).

При определении рабочего диапазона концентраций следует руководствоваться правилом:

Например: если для бактерии А и антибиотика Б диапазон МПК для контрольных штаммов составляет 2–4 мг/л, значение микробилогической точки отсечения составляет — 8 мг/л, а клинической — 16 мг/л, то в данном случае, согласно указанному выше правилу, следует выбрать следующие тестируемые концентрации: 0,5–1-2–4-8–16-32 мг/л.

Диапазоны концентраций антибиотиков для некоторых приоритетных бактерий представлены в таблице 10.

Диапазон рабочих концентраций для контрольного штамма может быть уже, чем диапазон концентраций для опытных изолятов и составлен только с использованием контрольного диапазона руководствуясь правилом:

Например, для ципрофлоксацина и штамма E. coli ATCC 25922 он составит: 0,001–0,002–0,004–0,008–0,016–0,03

Накопив достаточно данных по опытным изолятам и определив, в каких пределах может оказаться их МПК, диапазон рабочих концентраций необходимо, насколько это возможно, сузить с целью экономии места на планшетах и других ресурсов.

Интерпретацию результатов определения чувствительности можно проводить вручную или автоматически. При этом оптимальным является второй вариант, поскольку он способствует минимизации ошибок и повышения качества микробиологического заключения.

В таком случае важно применять специализированное программное обеспечение с обязательными компонентами:

автоматическая интерпретация количественных результатов определения чувствительности (определение категории чувствительности) согласно актуальным критериям;
автоматический анализ полученного фенотипа резистентности/чувствительности микроорганизма и формирование дополнительных комментариев по результатам анализа.

Таблица 10. Примеры диапазонов концентраций антибиотиков в отношении приоритетных бактерий

Антибиотик	Контрольный диапазон [23] , мг/л	Микробиологи ческая точка от сечения [19] , мг/л	Клиническая точка отсече ния EUCAST 2022 [20] , мг/л	Клиническая точка отсечения CLSI 2022 [22] , мг/л	Выбранные диапазо ны рабочих концентраций антибиотика в ячейках для опытных изолятов, мг/л
*E. coli и Salmonella spp. контрольный штамм — E. coli ATCC 25922)*
Ципрофлоксацин	0,004–0,016	E. coli — 0,06 S. enterica — 0,125	S ≤ 0,25, R > 0,5 Salmonella spp.: S ≤ 0,06, R > 0,06	S ≤ 0,25, I = 0,5, R ≥ 1 (только E. coli)	0,001–0,002–0,004–0,008–0,016–0,03–0,06–0,125–0,25–0,5–1–2
Цефотаксим	0,03–0,125	E. coli — 0,25 S. enterica — 0,5	S ≤ 1, R > 2	S ≤ 1, I = 2, R ≥ 4	0,001–0,002–0,004–0,008–0,016–0,03–0,06–0,125–0,25–0,5–1–2–4–8
Колистин	0,25–2	E. coli — 2 S. dublin — 16	S ≤ 2, R > 2	I ≤ 2, R ≥ 4	0,06–0,125–0,25–0,5–1–2–4–8
Хлорамфеникол	2–8	16	S ≤ 8, R > 8	S ≤ 8, I = 16, R ≥ 32	0,5–1–2–4–8–16–32–64
Ампициллин	2–8	E. coli — 8 S. enterica — 4	S ≤ 8, R > 8	S ≤ 8, I = 16, R ≥ 32	0,5–1–2–4–8–16–32–64
Тетрациклин	0,5–2	8	-	S ≤ 4, I = 8, R ≥ 16	0,125–0,25–0,5–1–2–4–8–16–32
Сульфаметоксазол	-	-	-	S ≤ 256, R ≥ 512	64–128–256–512–1024
Триметоприм/сульфаметоксазол	≤ 0,5	E. coli — 0,5	S ≤ 2, R > 4	S ≤ 2/38, R ≥ 4/76	0,125/2,4–0,25/4,8–0,5/9,5–1/19–2/38–4/76–8/152
Гентамицин	0,25–1	2	S ≤ 2, R > 2	S ≤ 4, I = 8, R ≥ 16	0,06–0,125–0,25–0,5–1–2–4–8–16–32
Меропенем	0,008–0,06	E. coli — 0,06	S ≤ 2, R > 8	S ≤ 1, I = 2, R ≥ 4	0,002–0,004–0,008–0,016–0,03–0,06–0,125–0,25–0,5–1–2–4–8
*Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium (Контрольный штамм — Enterococcus faecalis ATCC 29212)*
Ампициллин	0,5–2	E. faecalis — 4 E. faecium — 8	S ≤ 4, R > 8	S ≤ 8, R ≥ 16	0,125–0,25–0,5–1–2–4–8–16–32
Хлорамфеникол	2–8 (E. coli ATCC 25922)	32	-	S ≤ 8, I = 16, R ≥ 32	0,5–1–2–4–8–16–32–64
Ципрофлоксацин	0,5–2	E. faecalis — 4 E. faecium — 8	S ≤ 4, R > 4	S ≤ 1, I = 2, R ≥ 4	0,125–0,25–0,5–1–2–4–8
Эритромицин	-	4	-	S ≤ 0,5, I = 1–4, R ≥ 8	1–2–4–8–16
Гентамицин	4–16	E. faecalis — 64 E. faecium — 32	S ≤ 4, R > 4 (тест на вы- сокие уровни устойчивости)	-	1–2–4–8–16–32–64–128
Тетрациклин	0,5–2 (E. coli ATCC 25922)	4	-	S ≤ 4, I = 8, R ≥ 16	0,125–0,25–0,5–1–2–4–8–16–32
Ванкомицин	1–4	4	S ≤ 4, R > 4	S ≤ 4, I = 8–16, R ≥ 32	0,25–0,5–1–2–4–8–16–32–64
Бацитрацин	-	32	-	-	8–16–32–64
Вирджиниамицин	-	E. faecalis — 32 E. faecium — 4	-	-	1–2–4–8–16–32–64
*Campylobacter jejuni и Campylobacter coli (Контрольный штамм Сampylobacter jejuni 33560)*
Ципрофлоксацин	-	С. coli — 0,5 С. jejuni — 0,25	S ≤ 0,001, R > 0,5	-	0–0005-0,001–0,002–0,004–0,008–0,016–0,03–0,06– 0,125–0,25–0,5–1
Эритромицин	-	С. coli — 8 С. jejuni — 4	C. coli: S ≤ 8, R > 8 С. jejuni: S ≤ 4, R > 4	-	1–2–4–8–16
Гентамицин	-	2	-	-	0,5–1–2–4
Стрептомицин	-	4	-	-	1–2–4–8
Тетрациклин	-	С. coli — 2 С. jejuni — 1	S ≤ 2, R > 2	-	0,5–1–2–4

Концентрации в ячейках планшета, мг/л: 0–0005-0,001–0,002–0,004–0,008–0,016–0,03–0,06–0,125–0,25–0,5–1–2–4–8–16–32–64–128–256–512–1024.

Изменено 15 января 2024