Определение чувствительности бактерий к антибиотикам следует проводить в соответствии с Рекомендациями МАКМАХ «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам (2021)», составленными на основе стандартов EUCAST
[23]
, либо в соответствии с международно гармонизированными протоколами EUCAST или CLSI.
Протоколы EUCAST полностью гармонизированы с международными стандартами ISO
[24]
[25]
.
В большинстве случаев протоколы EUCAST и СLSI совпадают, однако для некоторых привередливых микроорганизмов имеются расхождения, например, в составе среды для кампилобактерий.
Предпочтительным является метод серийных разведений, поскольку он позволяет получить численное значение минимальной подавляющей концентрации.
6.1 Выбор разведений при постановке метода серийных разведений и контроль качества
При подготовке к постановке метода серийный разведений в бульоне встаёт вопрос: сколько лунок и с какими концентрациями антибиотиков запланировать для опытных изолятов каждой бактерии? Разведения антибиотика должны быть выбраны таким образом, чтобы с высокой вероятностью обнаружить концентрацию, соответствующую МПК, иначе опыт придётся переделывать, пока нужные разведения не будут подобраны эмпирически.
Перечень концентраций, которые определяются заранее с целью определить МПК всех опытных изолятов и контрольных штаммов называют диапазоном рабочих концентраций.
При выборе диапазона рабочих концентраций необходимо учитывать контрольные диапазоны, микробиологические и клинические точки отсечения.
Контрольный диапазон — это табличное значение диапазона МПК для контрольного штамма. Контрольный штамм — это штамм дикого типа, не обладающий приобретённой устойчивостью к тем антибиотикам, для контроля исследования, которых он предназначен.
Постановку контрольного штамма необходимо ставить в каждой серии с опытными образцами. Контрольные штаммы, предусмотренные международными стандартами методов определения чувствительности к антибиотикам (EUCAST и СLSI) — имеют порядковый номер коллекции ATCC (Американской коллекции типовых культур). Заказать их можно через различных зарубежных и отечественных поставщиков, также ряд отечественных медицинских и ветеринарных научных учреждений имеют эти контрольные штаммы в своих коллекциях с возможностью передачи. Если полученное для контрольного штамма в ходе эксперимента значение МПК находится в пределах контрольного диапазона, то результаты для опытных изолятов, поставленных в той же серии, можно считать валидными.
Если полученные для контрольного штамма значения МПК выходят за пределы контрольного диапазона, то опыт необходимо переделать. Возможно, проблема в том, что концентрация антибиотика не соответствует требуемой (например, ошибка в разведении, некачественный стандарт с содержанием антибиотика ниже заявленного).
Если концентрация антибиотика в реальности ниже ожидаемой, то полученное для контрольного штамма МПК будет смещено вправо относительно диапазона, т.е. превысит его верхний предел.
В целом, для контроля качества приоритетных групп бактерий оптимальной может быть признаны следующие положения:
Для E. coli и сальмонелл в каждой серии ставят контроли для всех антибиотиков со штаммом E. coli ATCC 25922.
Если для E. coli ATCC 25922 какого-то антибиотика нет, то следует брать в этом случае штамм Enterococcus faecalis ATCC 29212 так, чтобы для каждого антибиотика в каждой серии обязательно был контроль. В результате, для многих антибиотиков качество результатов будет проверено сразу по двум контрольным штаммам.
Для энтерококков используют штамм Enterococcus faecalis ATCC 29212.
Стрептомицин, сульфадиазин, сульфаметоксазол, эритромицин и др. можно ставить без контролей (поскольку для Enterococcus faecalis ATCC 29212 и E. coli ATCC 25922 контрольные значения отсутствуют).
Для кампилобактерий используют штамм Campylobacter jejuni ATCC 33560, а для антибиотиков не имеющих допустимых диапазонов для данного штамма, можно поступать как со стрептомицином, сульфадиазином и сульфаметоксазолом — ставить эксперимент без контроля.
Более подробно порядок проведения контроля качества изложен в Рекомендациях МАКМАХ «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам (2021)».
Существует также дополнительный инструмент контроля полученных данных — построение графика распределения МПК и сравнение его с табличными значениями EUCAST. Данный инструмент особенно актуален для антибиотиков, для которых отсутствуют контрольные диапазоны.
На графике распределения МПК по оси абсцисс отложены все значения МПК, зафиксированные для исследованных изолятов, а по оси ординат — доля изолятов с данным МПК среди общего количества изолятов. Зелёным или синим цветом на графике, как правило, обозначают столбцы чувствительных изолятов, МПК которых ниже точки отсечения, жёлтым — чувствительных при увеличенной экспозиции, красным — устойчивых.
Графики распределения МПК, полученные EUCAST, доступны на официальном сайте организации
[19]
.
Для примера на рисунке 1 представлен график распределения МПК тетрациклина для E. coli.
График распределения МПК тетрациклина для E. coli с официального сайта EUCAST
Чтобы увидеть график распределения, необходимо зайти в базу данных «MIC Distributions and ECOFFs» (Распределение МПК и микробиологические точки отсечения), выбрать бактерию и нажать на антибиотик из списка, либо, наоборот, выбрать антибиотик и нажать на бактерию. В таблице указано количество изолятов и на графике, которые были происследованы для его получения.Внешний вид базы представлен на рисунке 2.
Снимок экрана с базой данных «MIC Distributions and ECOFFs»
Система AMRcloud позволяет легко строить график распределения МПК для комбинаций «бактерия-антибиотик», исследованных в рамках программы AMRcloud (см. раздел 5 «Использование платформы AMRcloud в мониторинге антибиотикорезистентности» Руководства по мониторингу с AMRcloud, 5.3. Углублённый анализ данных, 5.3.1.3 Подвкладка «МПК»)
[16]
.
Если пики на табличном (с сайта EUCAST) и опытном графике совпадают, это является дополнительным подтверждением валидности результатов.
Если у опытного графика заметен явный сдвиг относительно табличного — на одну или несколько концентраций, это может свидетельствовать о проблемах, возникших при постановке
опыта.
После установления контрольных диапазонов выбирают тестируемые концентрации антибиотиков.
Далее при определении диапазона рабочих концентраций необходимо учесть:
Точки отсечения микробиологической устойчивости (ECOFF).
Точки отсечения клинической устойчивости по системе EUCAST.
Точки отсечения клинической устойчивости по системе CLSI.
Значения из таблиц МАКМАХ, EUCAST и СLSI интерпретируют следующим образом (Х — значение МПК опытного штамма, Min — минимальное значение, Maх — максимальное):
Микробиологическая устойчивость:
Если А ≤ Min, то изолят относится к категории S (чувствительный), если А > Min, то к категории — R (устойчивый).
Клиническая устойчивость по критериям EUCAST/МАКМАХ:
Если А ≤ Min, то изолят относится к категории S (чувствительный), если А > Min и А ≤ Max, то к категории «I» (ранее «промежуточно устойчивый», в настоящее время — «чувствительный при увеличенной экспозиции»), если А > Max, то к категории — R (устойчивый).
Клиническая устойчивость по критериям CLSI:
Если А ≤ Min, то изолят относится к категории S (чувствительный), если А > Min и А < Max, то к категории «I» (промежуточно устойчивый), если А ≥ Max, то к категории — R (устойчивый).
При определении рабочего диапазона концентраций следует руководствоваться правилом:
Например: если для бактерии А и антибиотика Б диапазон МПК для контрольных штаммов составляет 2–4 мг/л, значение микробилогической точки отсечения составляет — 8 мг/л, а клинической — 16 мг/л, то в данном случае, согласно указанному выше правилу, следует выбрать следующие тестируемые концентрации: 0,5–1-2–4-8–16-32 мг/л.
Диапазоны концентраций антибиотиков для некоторых приоритетных бактерий представлены в таблице 10.
Диапазон рабочих концентраций для контрольного штамма может быть уже, чем диапазон концентраций для опытных изолятов и составлен только с использованием контрольного диапазона руководствуясь правилом:
Например, для ципрофлоксацина и штамма E. coli ATCC 25922 он составит: 0,001–0,002–0,004–0,008–0,016–0,03
Накопив достаточно данных по опытным изолятам и определив, в каких пределах может оказаться их МПК, диапазон рабочих концентраций необходимо, насколько это возможно, сузить с целью экономии места на планшетах и других ресурсов.
Интерпретацию результатов определения чувствительности можно проводить вручную или автоматически. При этом оптимальным является второй вариант, поскольку он способствует минимизации ошибок и повышения качества микробиологического заключения.
В таком случае важно применять специализированное программное обеспечение с обязательными компонентами:
автоматическая интерпретация количественных результатов определения чувствительности (определение категории чувствительности) согласно актуальным критериям;
автоматический анализ полученного фенотипа резистентности/чувствительности микроорганизма и формирование дополнительных комментариев по результатам анализа.
Таблица 10. Примеры диапазонов концентраций антибиотиков в отношении приоритетных бактерий
