8. Пример решения практической задачи, связанной с мониторингом устойчивости зоонозных бактерий, выделенных от животных

• 8.1 Данные и цели
• 8.2 Решение задачи
• 8.3 Выводы

8.1 Данные и цели

Данные: устойчивость E. coli, выделенных от кур и коров к 10 антибактериальным средствам: ампициллину, цефотаксиму, хлорамфениколу, ципрофлоксацину, колистину, гентамицину, меропенему, моксифлоксацину, триметоприму и комбинации триметоприм-сульфаметоксазол (МПК).

Данные представляют собой реальный результат мониторинговых исследований ФГБУ «ВГНКИ». Более подробно с проводимым учреждением мониторингом можно ознакомиться на странице открытого проекта ФГБУ «ВГНКИ» в AMRcloud [7] .

Данные интерпретировалипо критериям клинической устойчивости EUCAST 2022 года (версия 12) [20] и критериям микробиологической устойчивости EUCAST ECOFFs [19] .

Цели:

• Провести анализ данных.
• Оценить валидность данных.
• Оценить наличие проблемы с устойчивостью кишечной палочки от животных.
• Выбрать приоритетный для внедрения мер по противодействию устойчивости вид животных.
• При необходимости, внести коррективы в планирование дальнейшего мониторинга.

8.2 Решение задачи

8.2.1. Обзор структуры данных

В первую очередь необходимо познакомиться с данными и изучить их структуру. Откроем вкладку «Структура данных», в окне «Структура данных по» в нижней части экрана слева по очереди выберем «Вид_животного», «Образец» и «Geo_point», каждый раз нажимая кнопку «Отобразить» для отображения диаграмм.

Все изоляты относятся к виду E.coli. Структура по видам животных показывает, что данные содержат МПК 237 изолятов от кур и 145 от коров, всего 382 изолята (рисунок 1).

Все изоляты от коров были выделены из фекалий, изоляты от кур были выделены из фекалий — 84 изолята и из смывов с тушки — 153 изолята (рисунок 2).

Можно выполнить оценку структуры данных в зависимости от места отбора проб.

Из рисунка 3 видно, что географический охват исследований составил 16 регионов России, от Южного Кавказа до Приморского края. Наибольшее количество изолятов было отобрано из Белгородской, Новосибирской, Калужской, Воронежской областей, Дагестана, Пензенской, Челябинской, Тверской областей, Республики Северная Осетия — Алания.

Таким образом, среди регионов с наибольшим количеством изолятов представлены разные части страны — Центральная Россия, Сибирь, Кавказ, Поволжье.

Это позволяет сделать вывод, что данные репрезентативны для страны и позволяют распространить выводы на отечественное сельское хозяйство в целом.

8.2.2. Спектр устойчивости к антибиотикам

Влияние вида образца

Все изоляты от коров были выделены из фекалий, а от кур — из фекалий и смывов с тушки.

Для того, чтобы корректно сравнивать данные от коров и кур, необходимо учитывать влияние фактора образца. Если спектры устойчивости изолятов от кур, выделенных из фекалий и смывов с тушки значительно различаются, для сравнения с изолятами от коров необходимо брать куриные изоляты только из фекалий. Если отличия между спектрами устойчивости куриных изолятов из фекалий и из смывов с тушек несущественное, для сравнения спектров устойчивости от кур и коров можно брать все изоляты от кур.

Посмотрим на спектры устойчивости изолятов от кур, выделенных их фекалий и из смывов с тушки. Для этого откроем вкладку «Антибиотики все», в поле «Вид_животного» выберем «Курица», а в поле «Образец» выберем сначала «Смыв с тушки», и, нажав кнопку «Отобразить», выведем на экран соответствующую диаграмму, а затем выберем «Фекалии».

Зелёный столбец на графиках — это доля изолятов из категории «Чувствительный», жёлтый столбец — доля изолятов из категории «Чувствительный при увеличенной экспозиции (ранее эта категория называлась «Промежуточно устойчивый», красный — из категории «Устойчивый». Значение «N» под столбцами показывает количество изолятов, исследованных на каждый антибиотик. Чёрточки вверху столба показывают диапазон значений в 95%-доверительном интервале.

Как видно из рисунка, значительное отличие заметно только для одного антибиотика — ампициллина, устойчивость к которому значительно выше у изолятов из фекалий.

Таким образом, для сравнения спектров устойчивости изолятов от коров и кур, для последних можно использовать объединённые данные по двумвидам образцов — смывам с тушки и фекалиям.

Сравнение спектров устойчивости от коров и от кур

Посмотрим спектр устойчивости отдельно для кур и для коров. Для этого необходимо открыть вкладку «Антибиотики (все)», в поле «Вид_животного» (вверху экрана на панели «Параметры основные») выберем сначала «Корова», а потом выберем «Курица», выводя графики на экран.

Из рисунков видно, что спектр устойчивости бактерий от кур и коров имеет значительные отличия. Практически ко всем исследованным антибиотикам устойчивость изолятов от кур значительно выше, чем от коров.

У изолятов от коров устойчивость к ампициллину, хлорамфениколу, гентамицину, триметоприму, комбинации триметоприм-сульфаметоксазол, колистину, цефотаксиму, ципрофлоксацину и левофлоксацину составила составила менее 15%. В то же время у выделенных от кур изолятов устойчивость к ципрофлоксацину, левофлоксацину, триметоприму и ампициллину была более 50%, к гентамицину, колистину и хлорамфениколу — от 20 до 50%, к цефотаксиму — порядка 10%, в отношении комбинации триметоприм/сульфаметоксазол 64% изолятов были отнесены к категории «чувствительные при увеличенной экспозиции». Таким образом, ситуацию с антибиотикорезистентностью в птицеводстве хуже, чем при выращивании КРС. Куры могут рассматриваться как приоритетный, по сравнению с коровами, вид животных для принятия управленческих мер, основа которых — минимизации использования антибиотиков.

8.2.3. Выбранные антибиотики

Целесообразно отдельно рассмотреть устойчивость к наиболее важным из исследованных антибиотиков, например, колистин (группа полимиксинов), цефотаксим (цефалоспорин III поколения) и фторхинолоны (ципрофлоксацин и левофлоксацин), все эти антимикробные средства указаны в рекомендациях международных организаций — ВОЗ, МЭБ и ФАО как антибиотики, применение которых в животноводстве представляет наибольший риск распространения антибиотикорезистентности среди зоонозных бактерий и угрозу здравоохранению [14] [15] [17] . Также к группе наиболее важных антибиотиков относится меропенем из класса карбапенемов. ВОЗ включила устойчивые к карбапенемам и продуцирующие БЛРС E.coli в группу критического приоритета для разработки новых антибиотиков [13] .

Устойчивых к меропенему изолятов не было выделено ни от кур, ни от коров, что говорит о том, что данный антибиотик, не зарегистрированный в России для продуктивных животных [18] , либо не применяется совсем, либо применяется редко.

Для цефотаксима, колистина, ципрофлоксацина и левофлоксацина для удобства построим графики зависимости устойчивости от вида животного и сравним данные с данными из Евросоюза. Поскольку в базе данных Евросоюза были использованы критерии микробиологической устойчивости EUCAST ECOFFs (Epidemiological Cut-off Values), точки отсечения эпидемиологической (микробиологической) устойчивости, используем интерпретацию данных по EUCAST ECOFFs.

В целом значения микробиологической устойчивости также важны для оценки распространения антибиотикорезистентности, и их следует использовать в мониторинге наряду со значениями клинической устойчивости.

Для построения диаграмм откроем вкладку «Выбранные антибиотики», затем в поле «Антибиотик» выберем «cefotaxime_sir» (либо сefotaxime_mic, если переключатель в поле «Источник данных S/I/R») стоит в позиции «Автоинтерпретация из МПК»). Откроем подвкладку «Группировать по» и в качестве группирующего признака выберем «Вид_животного», затем нажмем на кнопку «Отобразить». Повторим данные действия для ципрофлоксацина, левофлоксацина и колистина.

К цефотаксиму устойчивыми отказались 8% изолятов от коров и 10% изолятов от кур. Это относительно высокие значения. Так, в среднем по Евросоюзу согласно данным за 2020 год [3] , только 1,5% изолятов от бройлеров были устойчивы к цефотаксиму (при этом для отдельных стран были также зафиксированы высокие значения с максимумом для Мальты — 33%).

Устойчивыми к ципрофлоксацину и левофлоксацину оказались 88% изолятов от кур и 9% изолятов от коров. В Евросоюзе при этом средняя устойчивость была зафиксирована на уровне 55%, однако в отдельных странах достигала и намного больших значений, в частности 92% в Латвии и 96% в Словакии [3] .

К колистину устойчивыми оказались 7,6% изолятов от коров и 37% изолятов от кур. Последнее значение может быть сочтено чрезвычайно высоким. Так, по данным из Евросоюза за 2020 г., в среднем 1,2% изолятов E.coli от бройлеров [3] оказались устойчивыми к колистину, среди, которых данный показатель оказался значительно выше среднего — Болгария (6%), Кипр (10%), Германия (9%) и Румыния (4%).

Необходимо отметить, что такой высокий уровень устойчивости к наиболее важным антибиотикам характерен не только для нашей страны. Например, в Китае были зафиксированы уровни устойчивости к колистину кишечной палочки от бройлеров на уровне 35% [5] .

8.2.4. Диаграмма распределения МПК

С целью проверки валидности наших данных сравним распределение МПК с табличным на примере цефотаксима.

Для этого во вкладке «Выбранный антибиотик» откроем подкладку «МПК» и выведем на экран график распределения МПК для цефотаксима.

Чтобы увидеть табличное распределение EUCAST, необходимо воспользоваться разделом официального сайта [19] «EUCAST MIC distributions and ECOFFs» («Распределение МПК и микробиологические точки отсечения»), далее кнопка «Search database» («Поиск по базе данных»), выбираем из списка в поле «Antimicrobial» («Антимикробное средство») антибиотиков cefotaxime и в открывшемся списке бактерий выбрать «Escherichia coli», после чего на экран будет выведен график распределения.

Сравнение полученного графика с табличными показывает, что диапазон зафиксированных нами концентраций не выходит за рамки диапазона EUCAST, значения пиков также совпадают, из чего делаем вывод о валидности наших данных. Схожая картина была получена и для других антибиотиков.

Если полученный график оказался бы смещён в правую или левую сторону относительно табличного распределения, это бы не означало автоматически, что данные не валидны, но послужило бы указанием к более тщательному контролю качества другими способами, в частности, с использованием контрольных штаммов.

По оси Х на графике отложены значения МПК в мг/л, по оси У — доля изолятов, для которых было зафиксировано данное МПК. Как и на предыдущих диаграммах, зелёные столбцы обозначают изоляты в категории «Чувствительный», красные — в категории «Устойчивый».

На графике по оси Х — МПК в мг/л, по оси У — доля изолятов с указанным МПК (от общего количества исследованных).

8.2.5. Карта устойчивости

Чтобы выяснить, носит ли устойчивость локальный характер или характерна для масштабов всей страны, посмотрим карту устойчивости на примере ципрофлоксацина у изолятов от кур. Для этого во вкладке «Выбранный антибиотик» выберем подкладку «Карта» и выведем карту на экран.

Зелёный и красный цвет на кругах обозначают долю чувствительных и устойчивых изолятов, число — количество изолятов той или иной категории.

Из карты видно несмотря на то, что наибольшая доля устойчивых изолятов зафиксирована в Поволжье, в целом устойчивость достаточна распространена в разных частях страны.

Аналогичная картина глобальной устойчивости была получена и для других антибиотиков. Таким образом, устойчивость не фиксируется в каких-то отдельных регионов, но, скорее, распространена в масштабах всей страны.

8.2.6. Ассоциированная устойчивость

Матрица ассоциированной устойчивости

Построим матрицу ассоциированной устойчивости, чтобы определить вероятность наличия одновременной резистентности изолята к двум разным АМП.

Для этого во вкладке «Ассоциированная устойчивость» выберем подвкладку «Матрица».

Близкая к 100% ассоциированная устойчивость зафиксирована к двум антибиотикам из класса фторхинолонов — ципрофлоксацину и левофлоксацину. Наведя курсор на значение «100», в перекрестье между ципрофлоксацином и левофлоксацином увидим надпись «Если R к levofloxacin_mic → R к ciprofloxacin_mic = 100%», что означает, если N изолятов устойчивы к левофлоксацину, из них 100% будут устойчивыми и к ципрофлоксацину.

Наведя курсор на значение «99,35%» во втором перекрестье между ципрофлоксацином и левофлоксацином, увидим надпись «Если R к ciprofloxacin_mic → R к levofloxacin_mic = 99,35%», что означает, если N изолятов устойчивы к ципрофлоксацину, из них 99,35% будут устойчивыми и к ципрофлоксацину.

Также высокие уровни устойчивости видны и для других комбинаций антибиотиков, например, 91% изолятов, устойчивых к левофлоксацину, устойчивы также и к триметоприму.

Таким образом, ципрофлоксацин и левофлоксацин обладают практически 100%-ной перекрёстной устойчивостью. Для целей мониторинга целесообразно не расходовать ресурсы на анализ устойчивости к обоим антибиотикам, но для дальнейших исследований выбрать какой-то один из них. Ципрофлоксацин значительно более активно, чем левофлоксацин применяется в ветеринарии, а также более активно в медицине, и именно его из всех фторхинолонов в первую очередь включают в программы мониторинга устойчивости зоонозных бактерий. Следовательно, из двух фторхинолов в программе мониторинга целесообразно оставить ципрофлоксацин.

Множественная резистентность

Множественная резистентность является важным показателем устойчивости бактерий, соответствующие сведения предствавляют как в отчётах [2] , так и в научных публикациях [26] [27] . Как правило, это одновременная устойчивость как минимум к трём антимикробным средствам из разных классов.

Для определения мультирезистентности изолятов от кур во вкладке «Ассоциированная устойчивость» откроем подвкладку «Множественная устойчивость». В поле «Антибиотик» необходимо поставить галочки напротив представителя каждого класса антибиотиков. В представленном случае все антибиотики из разных классов, кроме ципрофлоксацина и левофлоксацина, из которых выберем первый.

В поле «R как минимум к N антибиотикам» выберем значение «3» и увидим, что 147 из 223 изолятов — 65,92% (59,48–71,82 в 95% доверительном интервале) обладают свойством мультирезистентности.

8.3 Выводы

По результатам анализа полученных данных могут быть сделаны следующие выводы согласно поставленным целям:

1. Сравнение спектра устойчивости изолятов E. coli, выделенных из фекалий кур и смывов с тушки, показало их высокую схожесть, таким образом, для дальнейших исследований можно брать любой из данных видов образцов.
2. Сравнение графиков распределения МПК, полученных в исследовании, с референтными значениями EUCAST показало, что данные валидны.
3. С учётом полученных данных о практически 100%-ной перекрёстной устойчивости левофлоксацина и ципрофлоксацина и более широкому применению последнего в ветеринарии и общественном здравоохранении, для целей дальнейшего мониторинга рекомендуется использовать именно ципрофлоксацин.
4. Высокие уровни устойчивости изолятов E. coli от кур к антибактериальным средствам, в том числе к наиболее важным — цефалоспоринам III и выше поколений (цефотаксим), фторхинолонам (ципрофлоксацин и левофлоксацин) и колистину. Это может быть связано с активным применением данных антибиотиков в птицеводстве с профилактическими целями.
5. Устойчивость не характерна для каких-то отдельных регионов, но может быть рассмотрена в масштабе всей страны.
6. Куры, по сравнению с коровами, приоритетны для внедрения мер по противодействию устойчивости, основой которых является минимизация применения антибиотиков.